iPon Cikkek

Az optikai mikroszkóptól a nanoszkópig

Dátum | 2014. 10. 12.
Szerző | Jools
Csoport | EGYÉB

Amikor a tudósok a 17. században először kezdték optikai mikroszkópokkal vizsgálni az élő szervezeteket, egy egészen új világ tárult fel előttük. Az eszköz azóta is a mikrobiológusok legfontosabb eszköze a sejtek, a baktériumok, a gombák és az egyéb apró élőlények tanulmányozására, mivel az azóta kifejlesztett technológiák többsége − például az elektronmikroszkópia − nem igazán alkalmas az élő biológiai entitások vizsgálatára, tekintve, hogy megfelelő működésükhöz úgy kell előkészíteni a mintákat, hogy az idővel a tanulmányozott lények pusztulását okozza. Az optikai mikroszkópoknak azonban van egy nagyon komoly, sokáig áthághatatlannak tűnő korlátjuk: mivel látható fénnyel üzemelnek, fizikailag behatárolt, hogy milyen méretű struktúrákat képesek megjeleníteni. Ezt a határt Ernst Abbe határozta meg 1873-ban, aki egy egyenlettel írta le, hogy az ilyen mikroszkópok maximális felbontóképessége egyebek mellett a megvilágító fény hullámhosszától is függ. Az Abbe által meghatározott feloldási határ léte abba a hitbe ringatta a 20. századi kutatókat, hogy sosem lesznek képesek a fény hullámhosszának körülbelül felénél, vagyis 0,2 mikrométernél kisebb dolgokat megfigyelni a hagyományos mikroszkópokkal.
Ez azt jelentette, hogy bár az olyan méretes sejtszervek, mint például a mitokondrium megjeleníthetőek voltak, a sejt kisebb elemeinek megtekintésére optikai eszközökkel nem volt remény. Így például nem lehetett hagyományos mikroszkópokkal tanulmányozni a fehérjék egymás közti interakcióit sem. A mikrobiológusok tehát kénytelenek voltak belenyugodni, hogy bár a sejt egyes szerkezeti elemeit látják a mikroszkóp alatt, azt sosem fogják tudni vizsgálni, hogyan sietnek dolgukra ennek a különös, élő városnak a lakói. Márpedig az egyes molekulák élőben történő nyomon követése nélkül nem sok remény maradt arra, hogy valaha is megértsük, hogyan működnek a minden élőlényt felépítő sejtek. Az idei évben három olyan kutató kapta a kémiai Nobel-díjat, akik sikerrel oldották meg az Abbe-határ átlépését. Bár a 19. századi tudós által megfogalmazott egyenlet továbbra is helytállónak tekinthető, Eric Betzig, Stefan W. Hell és William E. Moerner fluoreszcens molekulák használatával elérték, hogy immár nincs olyan apró sejtszintű folyamat, amelyet ne lehetne optikai módszerekkel vizsgálni.
Eric Betzig, Stefan Hell és William Moerner
Történetünk 1993-ban, Stefan Hell finnországi lakásában kezdődik. A Heidelbergi Egyetemen három évvel korábban doktori fokozatot szerző kutatónak egy kvantumoptikával foglalkozó tankönyv lapozgatása közben óriási ötlete támadt. Hell már a korábbi években is foglalkozott annak gondolatával, hogyan lehetne az Abbe-féle feloldási határt átlépni, németországi professzorai azonban erősen szkeptikusak voltak azzal kapcsolatban, hogy ez lehetséges lenne. A hazájában tapasztalt ellenállásnak nagy szerepe volt abban, hogy Hell elfogadta egy finn kollégája állásajánlatát, és a Turkui Egyetemen fluoreszcens mikroszkópiával foglalkozó kutatócsoportjában kezdett dolgozni. A már említett tankönyv lapozgatása közben Hell a stimulált emisszió kifejezésbe botlott. Abban a pillanatban belém villant, hogy ez olyasvalami, ami tényleg működhet, egy olyan nyom, amelyen végre el lehet indulni, emlékszik vissza később. A kilencvenes évek elején alkalmazott fluoreszcens mikroszkópiának nevezett technika lényege voltaképpen az volt, hogy a szakértők fluoreszcens molekulák segítségével igyekeztek képet alkotni a sejtek belsejéről. Rövid fénypulzusokkal egyebek mellett olyan antitesteket tettek átmenetileg fluoreszcenssé, amelyek specifikusan a sejtmagi DNS-hez kapcsolódtak. Ezek az antitestek aztán megmutatták, hogy a DNS a magon belül hol és hogyan van összecsomagolva. A módszer azonban csak akkor működött, ha a keresett molekularészletből vagy -típusból sok volt egy helyen: vagyis a DNS összegubancolódott csomója egyetlen tömegként látszott a felvételeken, az egyes szálakat viszont nem lehetett megkülönböztetni a képen.
Stefan Hell rájött, hogy stimulált emissziót használva létre lehetne hozni egyfajta nanoméretű zseblámpát, amely nanométerről nanométerrel pásztázza végig a sejtet. Ehhez egy lézernyalábra van szükség, amely képes kioltani a fluoreszcens molekulákat, mivel azok a nyalábbal érintkezve elveszítik energiájukat és elsötétülnek. Hell 1994-ben publikálta elképzelését: az általa stimulált emissziós kioltásnak (STED) nevezett eljárás lényege, hogy egy fénypulzussal gerjesztett állapotba hozzák az összes fluoreszcens molekulát, majd egy másik nyalábbal egy egyetlen nanométer átmérőjű terület kivételével mindet kioltják. Ezt a teljes vizsgált terület minden egyes kis négyzetén megismétlik, majd a részletekből összeállítják a teljes képet. Minél kisebb az az egység, amelyet az egyes alkalmakkor fluoreszkálni hagynak, annál magasabb felbontású lesz a végső felvétel. Ilyen módon tehát elviekben megszűntethető a feloldási határ. Bár Hell elméleti okfejtése kezdetben nem keltett túl nagy feltűnést szakmai körökben, mérsékelt visszhangja elég volt ahhoz, hogy munkát kapjon a göttingeni Max Planck Biokémiai Intézetben. Itt aztán nekilátott ötlete gyakorlati megvalósításának, és 2000-ben már az általa kifejlesztett STED-mikroszkóppal demonstrálta, hogy elképzelése valóban működőképes: egyebek mellett egy kólibaktériumról készített minden korábbi optikai felvételt meghaladó részletességű képet.
A másik két decemberben Nobel-díjat átvevő kutató egészen más oldalról közelítette meg a feloldási határ problémáját. Eric Betzig és W. E. Moerner egymástól függetlenül tevékenykedve járultak hozzá az egyes molekulákat is megjeleníteni képes nanoszkópia fejlődéséhez. Az első lépést az úton az jelentette, amikor Moernernek először sikerült egyetlen aprócska fluoreszcens molekulát megjelenítenie. A legtöbb kémiai vizsgálati metódus során a kutatók molekulák millióit vizsgálják egyszerre, a kísérleti végeredmény pedig egy, a sokaságból képzett „átlagos” molekulára vonatkozik. A szakértők ugyanakkor régóta álmodoztak arról, hogy milyen jó lenne, ha a molekulákat egyesével is vizsgálni lehetne, hiszen ezzel sokkal könnyebben tanulmányozhatóvá válnának a sejtek működési folyamatai. Így aztán óriási szenzációt keltett, amikor Moernernek 1989-ben sikerült egyetlen molekula fényelnyelését lemérnie. A szakértő ekkoriban az IBM kaliforniai kutatóközpontjában dolgozott, és hihetetlennek tűnő eredményével sokakat inspirált arra, hogy megpróbálkozzanak a lehetetlennel, és belevessék magukat a molekulákat egyesével vizsgáló képalkotó eljárások fejlesztésébe. Közéjük tartozott Eric Betzig is, akinek a munkásságáról rövidesen szintén szót ejtünk.
Egy E. coli baktérium képe hagyományos mikroszkóppal (balra) és Hell STED-mikroszkópjával (jobbra)
Moerner 1997-ben újabb fontos mérföldkőhöz érkezett: az ekkor már a Kaliforniai Egyetem dolgozó szakértő a zöld fluoreszcens proteinekre (GFP) támaszkodva folytatta tovább az optikai mikroszkópia forradalmasítását. Egyik kollégája, Roger Tsien azon dolgozott, hogy a szivárvány minden színében való fluoreszkálásra vegye rá a medúzákból izolált fehérjét. (Tsien 2008-ban két másik kutatóval együtt kémiai Nobel-díjat kapott a proteinek felfedezésében végzett kulcsfontosságú munkájáért.) A szakértők hamar észlelték, hogy milyen óriási lehetőségek rejlenek különleges proteinekben: géntechnológiával a legkülönbözőbb fehérjéket lehet fluoreszcens címkékkel ellátni, amelyek aztán ennek köszönhetően pontosan nyomon követhetővé válnak a sejten belül. Moerner azt is felfedezte, hogy a GFP egyik változata ki- és bekapcsolható. Ha az ilyen címkével ellátott fehérjéket 488 nanométeres hullámhosszú fénnyel világítják meg, a molekula világítani kezd, idővel azonban fénye elhalványul, és ezt követően a hullámhosszak többségével nem vehető rá újra arra, hogy fluoreszkálni kezdjen. Ha viszont pontosan 405 nanométeres hullámhosszú fény éri, újra felkapcsolódik, és ismét 488 nanométeren kezd sugározni. Moerner egy gélbe helyezve vizsgálta a fluoreszcens fehérjéket. Mivel a molekulák egymáshoz képesti távolsága meghaladta a 0,2 mikrométert, egy sima optikai mikroszkóppal is meg lehetett jeleníteni, ahogy az egyes molekulák apró lámpákként fel- és lekapcsolódnak. A szakértő tehát igazolta, hogy lehetséges az egyes fluoreszcens molekulák optikai úton történő irányítása.
Eric Betziget Stefan Hellhez hasonlóan karrierje korai szakaszától kezdve foglalkoztatta, hogyan lehetne átlépni az Abbe-féle feloldási határt az optikai mikroszkópiában. A kilencvenes évek elején a Bell Laborban dolgozó kutató egy újfajta eljárás, az úgynevezett közeli mező optikai mikroszkópia (NSOM) kidolgozásán tevékenykedett. Ennek lényege, hogy a vizsgált mintától néhány nanométeres távolságban elhelyezett tűszerű eszköz bocsátja ki a megvilágító fénynyalábot. Az eljárással szintén áthágható a feloldási határ, a módszernek azonban számos gyengesége akad. Ezek közül az egyik az, hogy a kibocsátott fény csak nagyon rövid távokon belül hatásos, így a sejt belsejének mélyén található struktúrákról nem igazán lehet tiszta képet alkotni vele. 1995-ben Eric Betzig arra a következtetésre jutott, hogy az általa kidolgozott eljáráson nem lehetséges többet javítani. Mivel munkahelyén sem igazán érezte jól magát, úgy határozott, hogy kilép állásából, és felhagy a kutatással. Mielőtt azonban ezt megtette, rendkívül érdekes elképzeléssel állt elő, amelynek azonban gyakorlati megvalósítását nem látta kivitelezhetőnek: felmerült benne, hogy különböző tulajdonságú, például különböző színben fluoreszkáló molekulák révén talán megoldható lehet feloldási határ átlépésének problémája.
Úgy képzelte el, hogy hagyományos mikroszkópjával egy-egy képen rögzítené meg az egyforma színű, egymástól 0,2 mikrométernél távolabb elhelyezkedő molekulákat, majd a különböző színeket megörökítő felvételeket egymásra vetítené. A teljes kép felbontása így sokkal magasabb lenne, mint amit a feloldási határ elviekben megenged, hiszen a vörösen, sárgán és zölden ragyogó molekulák akkor is megkülönböztethetőek lennének egymástól, ha távolságuk alig néhány nanométert tenne ki. Elméletben mindez nagyon jól hangzott, az azonban világos volt, hogy az ötlet megvalósulása előtt néhány fontos gyakorlati problémát meg kell oldani. Ezek közül a legjelentősebb az volt, hogy ekkor még nem álltak rendelkezésre olyan jelzőmolekulák, amelyek kellően eltérő optikai tulajdonságokkal rendelkeztek volna. Betzig tehát 1995-ben publikálta elképzeléseit, majd felhagyott a kutatással, és apja cégénél kezdett dolgozni. A szakértő ezt követően évekre kiesett tudományos élet vérkeringéséből, míg egy napon a kezébe nem akadt egy cikk, amelyben a zöld fluoreszcens proteinről írtak. Betzig rögtön észlelte, hogy ez a fehérje jelentheti a megoldást elmélete megvalósítására. Az igazi áttörésre 2005-ben került sor, amikor a kutatáshoz ismét visszatérő tudós rátalált egy fluoreszcens fehérjetípusra, amely a Moerner által felfedezett proteinhez hasonlóan kizárólag megfelelő hullámhosszú fénysugarakkal aktiválható. A kutató ekkor rádöbbent, hogy módszerének kivitelezéséhez tulajdonképpen nincs is szükség arra, hogy a molekulák eltérő színben világítsanak, elég az is, ha eltérő hullámhosszú nyalábok hatására kezdenek fényleni.
A lizoszóma membránjának optikai mikroszkópos (balra) és Betzig-féle képe (középen), illetve ez utóbbi felvétel egyik részlete kinagyítva (jobbra)
Betzig kollégái segítségével egy éven belül igazolta, hogy a metódus a gyakorlatban is működik. A szakértők többek közt a lizoszómát beborító membrán alkotóelemeit látták el különböző fluoreszcens címkékkel. Ezeket aztán külön-külön aktiválták, és mivel az egyszerre felfénylő fehérjék 0,2 mikrométernél nagyobb távolságra voltak egymástól, egy optikai mikroszkóppal pontosan meghatározható volt a helyzetük. Elhalványodásuk után aztán egy másik típusú fluoreszcens címkével ellátott csoportot aktiváltak, és ezek pozícióját is meghatározták. A képeket a vizsgálat végén egymásra vetítették, és megkapták a lizoszóma membránjának szuperfelbontású képét. Betzig, Hell és Moerner munkásságának köszönhetően a nanoszkópiát napjainkban már a világ minden táján használják. A három kutató jelenleg is aktív, és folyamatosan azon dolgoznak, hogy az általuk kidolgozott technológiák egyre jobbak legyenek. Ezen túl számos jelentős mikrobiológiai felfedezés köthető a nevükhöz: Hell volt az első, aki beletekintett egy élő idegsejtbe, hogy mindennél pontosabb képet kapjon az agyi szinapszisok működéséről, Moerner a Huntington-kórral kapcsolatba hozható fehérjék kutatásában ért el kulcsfontosságú eredményeket, Betzig pedig egyebek mellett embriókban vizsgálta a sejtosztódás folyamatát.
Új hozzászólás írásához előbb jelentkezz be!

Eddigi hozzászólások

3. temp123456
2014.10.14. 22:39
uhh, sajat tab-ot kaptak az ilyen hirek? jolvan, meg is erdemli
 
Válasz írásához előbb jelentkezz be!
2. Imi3est
2014.10.15. 11:59
Jó cikk, írhattok még a mikroszkópiáról
 
Válasz írásához előbb jelentkezz be!
1. TheEnginee...
2014.10.16. 16:49
Jo cikk, köszönet erte.
Azert ne felejtsük el a röntgen mikroszkopiat sem.
Ott a lmabda kicsit alacsonyabb mint vizualis feny eseteben...
 
Válasz írásához előbb jelentkezz be!